L'information initiale est tout d'abord étudiée, analysée et évaluée par une unité spécifique de l'Office. Sur base de cette première évaluation, le Directeur Général décide de l'ouverture de l'enquête et transmet le cas aux enquêteurs.
Les enquêteurs internes examinent les faits sélectionnés en toute objectivité sans se laisser influencer par l’évaluation primaire. Ils rassemblent des preuves permettant d’établir les faits et rédigent un rapport circonstancié. Ils peuvent démontrer soit la culpabilité, soit l'innocence du suspect et/ou établir les responsabilités en fonction du poste occupé par la personne sous enquête.
Pour ce faire, ils recueillent et analysent tous les documents et toutes les données à leur disposition et interrogent les témoins et suspects potentiels. Des visites dans les locaux des Institutions européennes et des contrôles auprès d'opérateurs économiques peuvent également être effectués dans le cadre d'enquêtes sur le personnel de l'UE.
L'OLAF exécute les missions qui lui sont confiées avec intégrité, impartialité et professionnalisme, dans le respect des droits fondamentaux et libertés des personnes physiques et morales, en conformité avec les dispositions obligatoires de la Charte des droits fondamentaux de l’Union européenne. Ses unités d'enquête se composent d'enquêteurs, juristes, analystes et spécialistes possédant des qualifications professionnelles diverses qui sont mobilisées pour les besoins des enquêtes (inspecteurs des impôts, auditeurs, informaticiens, anciens militaires, comptables, réviseurs, juristes, économistes, anciens agents de douane, anciens magistrats, anciens agents de police et anciens procureurs).